林硕课题组在斑马鱼基因组编辑方法学领域取得重要进展

作者:scbb    时间:2015-09-11 14:25:55    点击率:
        CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)/Cas9技术由于有着易设计、造价低等优点,在斑马鱼基因组编辑领域已被普及,其中来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。这套系统由Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链)和sgRNA(single guide RNA,利用基因工程手段对crRNA和tracrRNA得到的融合物)组成。Cas9蛋白首先与sgRNA结合成复合物,然后通过识别PAM序列(5’-NGG-3’)侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。现行用于合成斑马鱼gRNA的质粒大多含有T7 启动子,使得斑马鱼目的基因DNA序列被限制于“5’-GG-N18-NGG-3’”的形式(理论靶位点概率为1/128),这对基因组进行精确编辑或同源重组操作有都较大选择局限性。
        为此,我们引入了Csy4蛋白策略帮助合成gRNA。Csy4蛋白能识别含有特定的RNA序列并进行切割。于是在合成斑马鱼基因组gRNA的质粒骨架中紧接T7启动子序列之后引入Csy4的结合位点,由此骨架合成的pre-gRNA经过Csy4的共孵育可释放出不受T7启动子限制的gRNA,理论靶位点概率提高到1/8,极大方便基因组精确编辑靶位点的选取。这个策略在斑马鱼中敲除EGFPtyrurodmib、susd4等基因中得到应用,证明其有效及普适性,为下一步利用斑马鱼构建人类单基因突变疾病模型打下基础。这项工作已被发表在Cell Research (2015) 25:1074–1077.(Wei Qin*, Fang Liang*, Yan Feng, Haipeng Bai, Ruibin Yan, Song Li and Shuo Lin. *co-author)

文章链接http://www.nature.com/cr/journal/v25/n9/full/cr201595a.html