CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)/Cas9技术由于有着易设计、造价低等优点，在斑马鱼基因组编辑领域已被普及，其中来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。这套系统由Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链）和sgRNA（single guide RNA，利用基因工程手段对crRNA和tracrRNA得到的融合物）组成。Cas9蛋白首先与sgRNA结合成复合物，然后通过识别PAM序列（5’-NGG-3’）侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。现行用于合成斑马鱼gRNA的质粒大多含有T7 启动子，使得斑马鱼目的基因DNA序列被限制于“5’-GG-N₁₈-NGG-3’”的形式（理论靶位点概率为1/128），这对基因组进行精确编辑或同源重组操作有都较大选择局限性。
        为此，我们引入了Csy4蛋白策略帮助合成gRNA。Csy4蛋白能识别含有特定的RNA序列并进行切割。于是在合成斑马鱼基因组gRNA的质粒骨架中紧接T7启动子序列之后引入Csy4的结合位点，由此骨架合成的pre-gRNA经过Csy4的共孵育可释放出不受T7启动子限制的gRNA，理论靶位点概率提高到1/8，极大方便基因组精确编辑靶位点的选取。这个策略在斑马鱼中敲除EGFP、tyr、urod、mib、susd4等基因中得到应用，证明其有效及普适性，为下一步利用斑马鱼构建人类单基因突变疾病模型打下基础。这项工作已被发表在Cell Research (2015) 25:1074–1077.（Wei Qin*, Fang Liang*, Yan Feng, Haipeng Bai, Ruibin Yan, Song Li and Shuo Lin. *co-author）
文章链接http://www.nature.com/cr/journal/v25/n9/full/cr201595a.html